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Elabscience Caspase 1活性檢測(cè)試劑盒怎么用?

 更新時(shí)間:2023-12-21 點(diǎn)擊量:479

Elabscience®自主研發(fā)的 Caspase 1 Activity Assay Kit 采用分光光度法,可用于檢測(cè)細(xì)胞、組織裂解液或其它樣本的caspase 1 活性。那么你知道Elabscience Caspase 1活性檢測(cè)試劑盒該怎么用嗎?讓我們一起來(lái)看看吧!

一、準(zhǔn)備工作

1. Cell Lysis Buffer 溶解后混勻,冰浴備用。

2. 2×Reaction Buffer 溶解后混勻,冰浴備用。

3. Ac-YVAD-pNA 和 pNA 溶解后混勻,冰浴備用。

二、樣本準(zhǔn)備

1. 細(xì)胞樣本

按照常規(guī)方法收集細(xì)胞沉淀,PBS 重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù),600×g離心 5 min,棄上清,按照每 100 萬(wàn)細(xì)胞加入 100 μL Cell Lysis Buffer 的比例加入預(yù)冷的 Cell Lysis Buffer 重懸細(xì)胞,在冰浴條件下裂解 30 min,裂解期間需渦旋震蕩 3~4 次,每次 10 s。裂解后的樣本,于 4°C,11000 ×g 離心 10~15 min,小心地吸取上清至新的 EP 管中,并置于冰上待用。同時(shí)使用 Bradford 法(E-BC-K168-M)測(cè)定蛋白濃度。

2. 組織樣本

取50 mg待測(cè)組織樣本,用PBS或者生理鹽水清洗1-2次,去除組織中殘留的血細(xì)胞,用手術(shù)剪剪碎,加入200μL 預(yù)冷的Cell Lysis Buffer,進(jìn)行勻漿(在冰浴條件下進(jìn)行,若組織質(zhì)量加倍時(shí),加入的預(yù)冷Cell Lysis Buffer 也需加倍)。將勻漿好的樣本轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中,冰浴裂解30min。裂解后的樣本,于 4°C,11000×g離心10~15min,小心地吸取上清至新的EP管中,并置于冰上待用。同時(shí)使用 Bradford法(E-BC-K168-M)測(cè)定蛋白濃度。

三、實(shí)驗(yàn)步驟

1. 制備 pNA 標(biāo)準(zhǔn)曲線(選做)

1) 配制標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液:取冰浴的 Cell Lysis Buffer 和2×Reaction Buffer,按照 1:1 配制標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液,渦旋或吹打混勻。

2) 進(jìn)行倍比稀釋:取6支EP管,第一支EP管中加入294 μL標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液,其他每管中加入150 μL標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液,從pNA (10 mM)的標(biāo)準(zhǔn)品中吸取6 μL到第一支 EP管中混勻配成 200 µM 的標(biāo)準(zhǔn)品工作液,吸取150 μL 到第2支EP管,混勻后吸取150 μL到第3支EP管,按此步驟往后依次吸取混勻至第5支EP管,如下圖所示:


3) 每管取100 µL不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品置于酶標(biāo)板或比色皿中,檢測(cè)405 nm下 OD值。(為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性,建議所有的待測(cè)樣本和標(biāo)準(zhǔn)品都設(shè)立復(fù)孔。)

4) 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線:分別以標(biāo)準(zhǔn)品濃度和對(duì)應(yīng)絕對(duì)OD值(每一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品的 OD405減去不含pNA的OD405)作為x軸和y軸,使用圖形軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,如下圖所示。實(shí)測(cè)數(shù)據(jù)可能因?qū)嶒?yàn)條件、檢測(cè)儀器等的不同而存在差異,圖中數(shù)據(jù)僅供參考。

2. Caspase 1 的活性檢測(cè)

1) 取 50 μL 樣本裂解液,按照下表設(shè)置反應(yīng)體系。


空白孔

樣本孔

Cell Lysis Buffer

50 µL

0 µL

2×Reaction Buffer

45 µL

45 µL

待測(cè)樣品

0 µL

50 µL

Ac-YVAD-pNA

5 µL

5 µL

總體積

100 µL

100 µL








2) 加入 Ac-YVAD-pNA 后混勻,37°C 孵育 1~2 h,發(fā)現(xiàn)顏色變化較明顯時(shí)即可檢測(cè) OD405。若顏色變化不明顯,可適當(dāng)延長(zhǎng)孵育時(shí)間到 4 h。

更多有關(guān)Elabscience Caspase 1活性檢測(cè)試劑盒的使用方法,請(qǐng)聯(lián)系Elabscience試劑盒代理——北京百奧創(chuàng)新科技有限公司。


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